上一回，招財(cái)貓講述了蛋白質(zhì)檢測(cè)的幾種常用方法，基于質(zhì)譜技術(shù)的 label free、iTRAQ/TMT、DIA、PRM 以及基于免疫技術(shù)的液相懸浮芯片。這一回，招財(cái)貓來(lái)講述一篇蛋白組學(xué)的文章。

我們以前熟悉的研究，往往從轉(zhuǎn)錄組起始，測(cè)得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后，尋找差異表達(dá)顯著的基因。然后，分別有生物標(biāo)志物方向和機(jī)制研究方向，兩種套路成文。蛋白組學(xué)也有類(lèi)似的套路。今天，招財(cái)貓講述的文章是機(jī)制研究方向的。我們來(lái)看下吧！

文章展示

文章如上，我們一看標(biāo)題就知道是機(jī)制方向：XX 基因?qū)е履撤N疾病進(jìn)展（惡化∕好轉(zhuǎn)），通過(guò) XX 通路。本文研究的疾病是黑素瘤（melanoma），關(guān)注的點(diǎn)是黑素瘤轉(zhuǎn)移（melanoma metastasis）。

研究思路

首先，樣本是建立的轉(zhuǎn)移細(xì)胞株。圖 1 說(shuō)明細(xì)胞系建立方法，并驗(yàn)證了一些關(guān)鍵的指標(biāo)證明細(xì)胞系已建立。建立方法是將小鼠黑色素瘤細(xì)胞系 B16F10，及人黑色素瘤細(xì)胞系 A375 通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，取肺轉(zhuǎn)移組織，取原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)移細(xì)胞株 B16F10M 和 A375M。下圖展示了形態(tài)（偽足形態(tài)），并表達(dá)了更高的增殖細(xì)胞核抗原（PCNA），證明構(gòu)建是成功的。

圖 1

然后，取細(xì)胞株 B16F10 和 B16F10M，進(jìn)行 iTRAQ 蛋白定量檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性 B16F10M 細(xì)胞株中 WDR74 的表達(dá)較對(duì)照組 B16F10 細(xì)胞株增加（差異倍數(shù) =2.25，p<0.01）。然后用 qPCR 驗(yàn)證了 RNA 水平上、免疫印跡驗(yàn)證蛋白水平上的 WDR74，在兩種細(xì)胞中，WDR74 確實(shí)存在差異表達(dá)——招財(cái)貓說(shuō)，這次 RNA 水平和蛋白水平一致了，沒(méi)有落入那“60%”里面去（有了 RNA-seq,，還需要蛋白質(zhì)檢測(cè)嗎？）。

圖 2

在真實(shí)組織里也檢測(cè)了 WDR74 的表達(dá)，結(jié)果顯示，從正常皮膚發(fā)展到痣到原發(fā)性黑色素瘤再到轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，WDR74 的表達(dá)是不斷增加的（圖略）。

到此，由高通量的蛋白組學(xué)方法（本文是 iTRAQ）篩選到了 WDR74，然后由低通量的 qPCR 和免疫印跡驗(yàn)證表達(dá)。所以我們的目標(biāo)分子選定了，下面就是進(jìn)行功能研究了。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

采用 A375 細(xì)胞系，對(duì) WDR74 進(jìn)行過(guò)表達(dá)和敲除，其中敲除采用的是 CRISPR/Cas9 方法，具體介紹請(qǐng)見(jiàn)招財(cái)貓以前的文章（CRISPR∕Cas9 基因編輯技術(shù)），然后檢測(cè)了細(xì)胞表型，這里檢測(cè)的是細(xì)胞周期、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲（基本把所有細(xì)胞表型都做了）。結(jié)果表明，WDR74 在 A375 細(xì)胞中，能促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展和細(xì)胞增殖，并抗細(xì)胞凋亡——是的，邏輯上與之前的病理結(jié)果相符，將 WDR74 與黑素瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，進(jìn)一步證明為因果關(guān)系（原文圖 2、3）。

機(jī)制研究

本文的思路是，發(fā)掘前期的研究結(jié)果，聯(lián)系本次發(fā)現(xiàn)的新分子。前期的眾多研究顯示，在多種腫瘤中，腫瘤的進(jìn)展與 RP–MDM2–p53 通路相關(guān)。那么 WDR74 是否也與此通路相關(guān)？還是采用 A375 的 WDR74 過(guò)表達(dá)和敲除細(xì)胞株，先關(guān)注一下通路蛋白在過(guò)表達(dá)和敲除細(xì)胞株里的表達(dá)變化，進(jìn)行 Western Blot。結(jié)果表明，p53、MDM2、RPL5 的表達(dá)量，都與 WDR74 的表達(dá)量相關(guān)，并且，p53 的下游基因，VEGFA、caspase 等，也都與 WDR74 的表達(dá)量相關(guān)。

圖 3

機(jī)制還需要證明相互作用。作者證明，WDR74 對(duì)于 p53 和 MDM2 的結(jié)合是必需的。

圖 4

作者還進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)，在已建立的 WDR74 的過(guò)表達(dá)和敲除穩(wěn)定株的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)入了 p53、MDM2 的 siRNA，然后檢測(cè)各相關(guān)分子的表達(dá)，及細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果要與前面的單 WDR74 的過(guò)表達(dá)及敲除穩(wěn)定株的結(jié)果相比，表明了上下游的邏輯關(guān)系——在此分子上游的仍受 WDR74 影響，在此分子下游的不受 WDR74 影響。圖 F 證明了 p53 是位于通路的下游，切斷 p53 這環(huán)就切斷了 WDR74 對(duì)細(xì)胞的影響。圖 G 表明 RPL5 是 MDM2 的上游，p53 是 MDM2 的下游。

圖 5

機(jī)制圖

根據(jù)以上邏輯關(guān)系，作者畫(huà)了一個(gè)機(jī)制圖：

圖 6

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

在裸鼠中，注射 WDR74 的過(guò)表達(dá)和敲除穩(wěn)定株進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，WDR74 促進(jìn)了黑素瘤瘤體生長(zhǎng)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。原文圖 6。

文章點(diǎn)評(píng)

招財(cái)貓點(diǎn)評(píng)：從這個(gè)文章的套路看來(lái)，此蛋白組的機(jī)制文章與轉(zhuǎn)錄組的機(jī)制文章基本一樣，都是用組學(xué)進(jìn)行篩選，低通量驗(yàn)證選取的蛋白的表達(dá)，然后選取特定基因，進(jìn)行功能研究。功能研究，還是我們?cè)瓉?lái)講過(guò)的那套方法，過(guò)表達(dá)和敲除，在細(xì)胞模型中檢測(cè)表型，驗(yàn)證機(jī)制，在動(dòng)物模型中進(jìn)一步驗(yàn)證表型。

總之，本文結(jié)構(gòu)非常完整，并且中規(guī)中矩，算是一篇還不錯(cuò)的文章。要使文章 blingbling 地閃閃發(fā)亮，似乎做到這種程度還不夠。要怎樣才可以呢？請(qǐng)跟緊招財(cái)貓，后續(xù)介紹！

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