單細胞測序技術為基礎科研、臨床診斷、藥物研發(fā)等領域提供了諸多全新發(fā)現(xiàn)視角。現(xiàn)階段主流的單細胞測序，大多是基于 10X?Genomics、BD Rhapsody 等單細胞捕獲設備獲得 cDNA 后進行打斷、擴增、建庫，并用二代測序分析基因的整體定量。然而，基因在不同組織、不同細胞亞群中會使用 mRNA 的不同轉(zhuǎn)錄本，同時也包括 InCRNA；此外 SNV、融合基因等結構變異也具有組織和細胞特異性，目前基于二代測序的單細胞數(shù)據(jù)局限于 3'或 5' 端的 100~150bp，因此較難滿足這類需求：而傳統(tǒng)的 Smart-seq 雖然可以實現(xiàn)全長轉(zhuǎn)錄本覆蓋，但轉(zhuǎn)錄本結構分析需要經(jīng)過組裝且細胞通量較低，成本較高，研究單細胞水平的可變剪切仍然較為困難。

三代測序如 Pacbio、Nanopore 等技術能夠以其長讀長的優(yōu)勢解決這一痛點。因此，如果能將二代測序與三代測序相結合，既能獲得 mRNA 的全長序列，并通過 Cell?Barcode 信息定位到細胞亞群，即可解決這一單細胞研究領域的痛點。但是，我們在前期測試中發(fā)現(xiàn)，二代單細胞測序一般獲得約 3 萬個基因的表達矩陣，三代全長測序能獲得超過 10 萬個轉(zhuǎn)錄本的表達矩陣，兩套數(shù)據(jù)的聚類圖譜差異巨大，現(xiàn)有的分析流程并未很好的解決兩套數(shù)據(jù)的整合問題。因此，如何從龐大的二代 + 三代，也即基因 + 轉(zhuǎn)錄本的單細胞數(shù)據(jù)中，挖掘到有價值的特異性轉(zhuǎn)錄本，能夠為單細胞臨床轉(zhuǎn)化、藥物靶點發(fā)現(xiàn)帶來更加精細的挖掘角度。

伯豪生物基于十多年的單細胞組學服務經(jīng)驗，可提供從樣品保存、運輸、單細胞懸液制備，到單細胞分選、建庫和數(shù)據(jù)分析的解決方案。同時，及智醫(yī)學團隊出身單細胞科研服務行業(yè)，重點圍繞單細胞富集與檢測平臺、單細胞測序技術平臺和基于 AI 算法的單細胞數(shù)據(jù)分析算法平臺。建立了單細胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、單細胞聯(lián)合 Bulk 多組學等多種獨特的分析流程和方法，尤其擅長各類免疫細胞與基質(zhì)細胞的分類、功能解析、細胞互作、藥物靶點篩選等分析項目。最終通過積累的上百種單細胞分析方法與百萬級別單細胞數(shù)據(jù)庫，為單細胞臨床轉(zhuǎn)化類項目提供專業(yè)研發(fā)服務。團隊生信專家通過高效的自動化分析腳本，并歷時數(shù)月的二代 + 三代單細胞算法測試，目前已經(jīng)解決了二代 + 三代單細胞聚類的諸多分析難點。

伯豪生物與及智醫(yī)學強強聯(lián)合，正式推出單細胞全長轉(zhuǎn)錄本測序服務，即單細胞 cDNA 水平的轉(zhuǎn)錄、遺傳變異研究，通過一次捕獲，兩次建庫，同時獲得單細胞聚類與轉(zhuǎn)錄本信息：

目前，該技術方向為如下科研問題，提供了潛在的解決辦法：

1、發(fā)現(xiàn)不同細胞攜帶的突變，攜帶突變的細胞與非突變細胞相比、攜帶不同突變類型的細胞相比，挖掘基因表達規(guī)律；

2、挖掘功能基因，如膜蛋白、分泌蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等編碼基因的轉(zhuǎn)錄本使用情況，并發(fā)現(xiàn)全新功能的轉(zhuǎn)錄本；

3、發(fā)現(xiàn)融合基因所在的細胞亞群，研究它們與其它腫瘤細胞的擬時序分化關系；

4、發(fā)現(xiàn)亞群特異性的全新 IncRNA；

5、獲得亞群特異性表達的轉(zhuǎn)錄本，能夠輔助小核酸類藥物開發(fā)企業(yè)，針對該特異性轉(zhuǎn)錄本設計 siRNA 干擾片段，提升小核酸干擾靶點的有效性。

案例解析

2021 年 11 月 11 日，來自澳大利亞 ? 沃爾特 - 伊麗莎霍爾醫(yī)學研究所的 Tian 等人開發(fā)了一種基于 Nanopore 測序和 10X?Genomics 的全長轉(zhuǎn)錄組單細胞測序方法，分析單細胞中的全長異構體、可變剪接和突變檢測。研究成果發(fā)表在國際知名期刊 GenomeBiology (IF=13.6)，論文題目為 "Comprehensive?characterization?ofsingle-cell?full-length?isoforms?in?human?and?mouse?with?long-read?sequencing"。

文章中，使用 10X Genomics 技術分選得到單細胞的全長 cDNA 后，將 cDNA 一分為二，一份進行打斷建庫用于二代測序，另一份進行全長擴增建庫用于 Nanopore 三代測序。此時 Nanopore 的文庫上也包含了細胞 Barcode, 后續(xù)可以通過分析流程將三代測序和二代測序結果通過細胞 Barcode 一 一 對 應。通過這樣的方式，即實現(xiàn)了獲得全長轉(zhuǎn)錄本，分析亞群的特征性轉(zhuǎn)錄本使用，并同時拿到了突變所在細胞。

文章數(shù)據(jù)分析顯示其中 40%-60% 的 Nanoporereads 可以分配給預期的 Barcode, 并保留用于后續(xù)分析（圖 C)。在數(shù)據(jù)處理過程中，非全長且不能唯一分配給轉(zhuǎn)錄本的數(shù)據(jù)被丟棄。最終每個細胞的平均 UMI 為 10,000 至 60,000 個，并且與對應的短讀數(shù)據(jù)情況相符（圖 D)。Nanopore 和 Ilumina 數(shù)據(jù)的基因水平的 UMI 計數(shù)也高度一致（圖 E）

文章數(shù)據(jù)分析顯示其中 40%-60% 的 Nanoporereads 可以分配給預期的 Barcode, 并保留用于后續(xù)分析（圖 C)。在數(shù)據(jù)處理過程中，非全長且不能唯一分配給轉(zhuǎn)錄本的數(shù)據(jù)被丟棄。最終每個細胞的平均 UMI 為 10,000 至 60,000 個，并且與對應的短讀數(shù)據(jù)情況相符（圖 D)。Nanopore 和 Ilumina 數(shù)據(jù)的基因水平的 UMI 計數(shù)也高度一致（圖 E）

通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，CLL(慢性淋巴細胞白血病）細胞相比正常免疫細胞具有更高比例的新型轉(zhuǎn)錄本，特別是新型剪接的轉(zhuǎn)錄本。同樣，相比激活的干細胞，靜態(tài)肌肉干細胞也有更高比例的新型轉(zhuǎn)錄本（圖 D)。

分析發(fā)現(xiàn)，約 80% 的基因可以表達多種轉(zhuǎn)錄本（圖 E)，但是大多數(shù)基因主要表達 1 到 2 種轉(zhuǎn)錄本類型（圖 F)，約 30% 的基因含有多于一種的可變剪接事件，意味著 2 個最高表達的異構體可能涉及多個外顯子的復雜剪接變化而產(chǎn)生不同。

文章通過分析 CLL 數(shù)據(jù)，檢測到 CD45 的多種亞型（圖 G)，CD45 的表達通過 CITE-seg 進行驗證。CITEseg 可以同時檢測 RNA 和細胞表面蛋白，這種方法結合三代測序，可以對細胞表面蛋白進行更深入的分析和探索。

對 CLL 數(shù)據(jù)集進行分析，尋找只存在于癌細胞中的，且在不同的 CL 轉(zhuǎn)錄簇中具有不同等位基因頻率的 SNVS，通過經(jīng)典的曼哈頓圖最終發(fā)現(xiàn)四個變異在不同的 CLL 聚類呈現(xiàn)顯著差異（圖 C， 圖 ?D)。其中發(fā)現(xiàn)的 Gly101Val 突變，此突變已被證實通過降低 BCL2 對 venetoclax 的親和力而使患者對 venetoclax 治療產(chǎn)生耐藥性，通過分析發(fā)現(xiàn)患者 CLL2 攜帶約 25% 的 GIV101Va| 突變，并發(fā)現(xiàn)該突變不僅屬于亞克隆，而且與特定的轉(zhuǎn)錄簇相關（圖 E)。

單細胞全長轉(zhuǎn)錄本測序的樣品選擇與實驗細節(jié)

由于單細胞全長測序需要對 mRNA 反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 全長進行測序，核心是需要將完整的全長 cDNA 擴增至 2ug 的 ?Nanopore 建庫起始量，而常規(guī)單細胞是將一鏈 cDNA 做基礎擴增后全部打斷用來做建庫測序，因此，這一實驗細節(jié)就意味著單細胞全長測序需要額外質(zhì)控。

一、樣品選擇：

常規(guī)單細胞測序樣品來源分為新鮮采集與液氮速凍兩種類型，兩種類型的樣品需要兩種處理方式，新鮮采集樣品需要在 48h 內(nèi)制備懸波并上機，液氮速凍樣品需要將細胞膜破碎，丟棄細胞質(zhì)，分離提取細胞核，用單個核來做單細胞測序。

不過，由于細胞核里面的 RNA 大多為初始 RNA，包含有較多內(nèi)含子，而從初始 RNA 加工為成熱 mRNA 的過程大多發(fā)生在細胞質(zhì)中，因此，抽核類的項目并不太適用于單細胞全長測序。雖然在 2022 年 7 月份一篇 Nature?Biotechnoloey 的文章是對人腦抽核后的單細胞樣品進行三代全長測序，不過由于拿不到成熟 mRNA，文章是站在了特定基因在不同亞群的外顯子保留這樣的科研角度統(tǒng)計規(guī)律（如下圖）。文章角度非常新穎，也是科研界首次用單細胞全長測序發(fā)現(xiàn)，人腦中某些基因在不同亞群中使用不同的外顯子組合，生成多種編碼蛋白。不過，由于最終拿到的仍舊是細胞核內(nèi)的 RNA，后續(xù)還需要大量驗證工作，因此抽核后做單細胞全長測序的臨床轉(zhuǎn)化價值較小。所以，單細胞全長測序的項目最適宜采集新鮮樣品制備細胞懸液，捕獲成熟 mRNA 開展后續(xù)驗證工作。

經(jīng)三代單細胞全長測序發(fā)現(xiàn) CADMI 基因在人腦神經(jīng)元（興奮性、抑制性）、星膠、小膠、少突細胞亞群中，會使用不同的外顯子組合。原文也有用蛋白質(zhì)譜技術對這些外顯子的多肽產(chǎn)物進行驗證的工作。

二、懸液質(zhì)控：

在收集到新鮮樣品之后，可以使用單細胞組織保護液（伯優(yōu)?單細胞組織保存液）將樣品在 24h-48h 內(nèi)從臨床運輸至實驗室進行懸液解離，并通過顯微鏡、細胞計數(shù)儀檢測懸液質(zhì)量。

由于全長單細胞對 RNA 質(zhì)量要求較高，比較建議懸液活率在 85% 以上，同時用臺盼藍、AO/PI 雙染鑒定，并用顯微鏡仔細觀察細胞真實活率、紅細胞比例（紅細胞在光鏡下，可以觀察到圓餅狀的亮圈，中間有黑色小點，有經(jīng)驗的單細胞實驗員可以通過肉眼觀察判斷出來，而不少品牌的細胞計數(shù)儀有可能會把紅細胞計算為碎片，甚至檢測不到）。

另外，現(xiàn)階段二代單細胞測序，單個樣品的數(shù)據(jù)量大多為 100G，可以容納 5000-8000 左右的細胞捕獲量；而三代測序成本較高，站在節(jié)省經(jīng)費的角度，建議一方面準確的對細胞懸液的濃度進行測定（不可單純依靠細胞計數(shù)儀），來控制上機細胞總數(shù)（建議上機不超過 1 萬個細胞）；同時也要結合不同品牌單細胞捕獲設備的真實捕獲率（這點最好找成熟單細胞科研服務公司來完成）來進行綜合判定（建議捕獲不超 5000 個細胞如果超過 5000 需要增加三代測序數(shù)據(jù)量）。

三、文庫制備

單細胞全長轉(zhuǎn)錄本測序，只需要一次捕獲，拿到一鏈 CDNA 之后要立刻進行全長擴增，如下圖：

? 因此，就需要將已擴增好的 cDNA 全長進行質(zhì)控：

如上圖，cDNA 條帶主峰在 1 -1.5kb 左右，下一步可以聯(lián)系三代測序工廠寄送樣品，由他們進行建庫測序。但是，也要測序工廠及時反饋三代文庫的質(zhì)檢圖片，要求文庫主峰與 cDNA 條帶主峰一致，方可進行正式的 Nanopore 上機測序?qū)嶒灐?/font>

四、單細胞測序剩余樣本用于新的科研發(fā)現(xiàn)：

由于現(xiàn)階段三代全長測序的準確性不夠高，考慮到后續(xù)驗證工作，比較建議在單細胞上機之后，將剩余的細胞樣品進行凍存，從 DNA、RNA、蛋白三個層面開展后續(xù)驗證實驗：

1、DNA 水平：

在我們前期測試中發(fā)現(xiàn)，三代原始數(shù)據(jù)中基因單核苷酸結構變異 SNV(RNA 層面的 SNP、Indel)? 較多，為了拿到準確的，與 DNA 層面一致的突變信息，就需要結合 DNA 層面的檢測來共同篩選核心突變。有兩種做法：

第一，同時將腫瘤患者的外周血和單細胞實驗剩下的腫瘤細胞做全外顯子測序（兩個樣品的市場價合計不超 5000 元），通過 ? 腫瘤組織測出來的突變 ? 扣掉 ? 自身 PBMC? 的胚系突變，可以得到體細胞突變，將這些突變 ? 基因位點作為核心突變，利用自動化腳本，提取 ? 三代數(shù)據(jù)中的原始 reads，這些 reads 都帶有的 ?Cell?barcode 信息可以定位到突變所在的細胞與亞群！即可通過擬時序算法分析突變細胞 vs 非突變細胞的發(fā)育分化軌跡。

第二：做全基因組重測序（可以根據(jù)具體課題決定是否還需收集 PBMC），發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)變異 CNV，以及融合基因信息，將這些信息與三代全長進行聯(lián)合分析。后續(xù)分析內(nèi)容也極為豐富，可以展開多個科研角度的解釋。

2、RNA 水平：

在三代全長拿到特征性轉(zhuǎn)錄本之后，還需要做后續(xù)驗證，如果序列較少，可以通過 5'RACE、3'RACE 實驗拉全長獲得準確序列；如果候選轉(zhuǎn)錄本序列較多，也可以通過 Pacbio 直接做 ?Bulk? 測序（可以混樣測一份即可，目的是拿到序列），再結合單細胞全長轉(zhuǎn)錄本的特異性表達規(guī)律，可以快速、低成本獲得這些序列的完整信息，下一步即可通過構建動物模型，開展功能驗證工作。

3、蛋白層面：

現(xiàn)階段的單細胞測序大多是以基因作為靶點，但是從已經(jīng)發(fā)表的上萬篇單細胞數(shù)據(jù)中，也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)基因的表達特異性并不強，這個是現(xiàn)階段單細胞測序需要升級改進的核心關鍵點。而在真實組織中，基因在不同亞群中使用不同的轉(zhuǎn)錄本編碼多種蛋白產(chǎn)物。有了單細胞全長轉(zhuǎn)錄本技術，也就意味著可以將靶點發(fā)現(xiàn)從基因細化為轉(zhuǎn)錄本，挖掘轉(zhuǎn)錄本的蛋白編碼產(chǎn)物。因此，臨床轉(zhuǎn)化最核心的一步：膜蛋白層面，可以依靠全長轉(zhuǎn)錄本獲得一些全新的發(fā)現(xiàn)。

現(xiàn)有的蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術無法做到 ? 針對單個細胞進行廣泛的蛋白質(zhì)檢測，但是蛋白質(zhì)的編碼序列都是從 RNA 層面的轉(zhuǎn)錄本翻譯過來，轉(zhuǎn)錄本序列的檢測比蛋白質(zhì)的檢測要容易很多。所以，這個里面就依托一套簡單的邏輯：從 DNA 到 RNA 到蛋白的中心法則，即可做到通過單細胞全長轉(zhuǎn)錄本測序，發(fā)現(xiàn)亞群特異性轉(zhuǎn)錄本，再將轉(zhuǎn)錄本序列預測的多肽產(chǎn)物與蛋白質(zhì)譜打出來的多肽產(chǎn)物進行匹配，發(fā)現(xiàn)一條潛在的轉(zhuǎn)錄本 + 編碼產(chǎn)物，即為一條新型潛在靶點。其實，在腫瘤新抗原發(fā)現(xiàn)領域，這套序列預測 + 質(zhì)譜檢測的策略已經(jīng)非常成熟并目較為實用，因此，可以基干中心法則將這套成熟策略轉(zhuǎn)用到單細胞全長轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)新型蛋白編碼產(chǎn)物領域。

總結

綜上所述，單細胞全長轉(zhuǎn)錄本更適合做新鮮樣品，整體實驗過程并不復雜，基本上現(xiàn)階段單細胞科技服務類公司都能實現(xiàn)，只需要在幾個細節(jié)上稍加注意即可。

總結下來，單細胞全長測序的本質(zhì)只是對轉(zhuǎn)錄本加了 ? 細胞亞群 ? 的標簽，方便從數(shù)萬條轉(zhuǎn)錄本快速篩選到特異性表達的少數(shù)轉(zhuǎn)錄本。這個并不是一套全新開發(fā)的技術，只能算是從 DNA 到 RNA 到蛋白的一整套符合中心法則的單細胞多組學的技術方案。在我們前期拜訪前沿課題組的過程中，有不少研究員曾想過這樣的方法，只是行業(yè)內(nèi)缺乏前人嘗試，我們深入思者過這些細節(jié)后，發(fā)現(xiàn)這套方案從樣品的選擇，測序?qū)嶒灒瑪?shù)據(jù)呈現(xiàn)，均比現(xiàn)階段的單細胞二代測序更加實用，更加貼近臨床轉(zhuǎn)化。從另外一個角度，轉(zhuǎn)錄本是基因功能實現(xiàn)的最小細分單位，針對轉(zhuǎn)錄本研究的單細胞全長測序，算得上是轉(zhuǎn)錄組研究領域的終點站。

解析某腫瘤樣本單細胞全長轉(zhuǎn)錄本的實測數(shù)據(jù)

一、基礎質(zhì)控

詳細統(tǒng)計如下，實測基因是指在三代全長中測到的基因：

以膜蛋白為例，數(shù)據(jù)庫中收錄的人總膜蛋白有 5520 個，對應轉(zhuǎn)錄本有 49893 條；在該樣品中測到了 1906 個（大部分膜蛋白不一定會在該腫瘤中表達），對應轉(zhuǎn)錄本是 7739，其中與 Ensemble 完全匹配的轉(zhuǎn)錄本有 5401 條，新轉(zhuǎn)錄本 2338 條，意味著平均每個膜蛋白會表達 1 條新轉(zhuǎn)錄本。從總體統(tǒng)計來看，功能基因（膜蛋白、分泌蛋白、轉(zhuǎn)錄因子）會約 30% 的新轉(zhuǎn)錄本，IncRNA 由于目前數(shù)據(jù)庫收錄的并不多，所以有約 50% 的新 IncRNA。

二、轉(zhuǎn)錄本表達的可靠性：

如同二代單細胞測序一樣，三代全長測序同樣會統(tǒng)計每條轉(zhuǎn)錄本在該樣品中測到的總 count 數(shù)，截圖如下：

目前已經(jīng)發(fā)表的 SCI 文章，轉(zhuǎn)錄本 total?count>5 即可納入正常聚類分析，經(jīng)過實測建，議設置轉(zhuǎn)錄本 total?count>20（約占總轉(zhuǎn)錄本的 80%），作為驗證實驗的可靠候選。

三、轉(zhuǎn)錄本表達的特異性

單細胞全長轉(zhuǎn)錄本測序的一大核心應用，是發(fā)現(xiàn)亞群的特征性轉(zhuǎn)錄本。單細胞二代 + 三代的合并聚類、注釋如下：

總計分 B ?cels、T?cels、Monocyte?cells、Epithelial?cells 四大群。更精細的注釋，如 Memory?B、Treg、Naive?T、ExhaustT、Mac 等我們會在后續(xù)章 節(jié)陸續(xù)展開討論。

以 CART 治療領域的某明星分子 MUC1 為例，二代測序基因表達情況如下如下：

不過，該基因在三代全長測序中，并未測到該基因的轉(zhuǎn)錄本，下文有對此類現(xiàn)象的討論。

另外一個明星癌基因 MUC2 的表達展示：

在三代全長數(shù)據(jù)中，MUC2 測到了多條 Ensemble 數(shù)據(jù)庫中未收錄的全新轉(zhuǎn)錄本：

經(jīng)過后續(xù)的序列比對（如下圖紅色區(qū)域），發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本是已知轉(zhuǎn)錄本的一部分序列。

示例圖如下：

此外，全長轉(zhuǎn)錄本可以測到較多 lncRNA，下圖為 B 細胞中某條表達特異性 lncRNA：

綜合評價：

目前單細胞二代測序?qū)蜻M行表達定量的原理，是把該基因表達出來的所有轉(zhuǎn)錄本的 UM 進行求和，而三代測序是每條轉(zhuǎn)錄本進行單獨計數(shù)，如某個基因在在細胞的 count 值是 100，理論上來說，在三代轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)中，可以對應找到 100 條轉(zhuǎn)錄本 UM1。不過，就實際情況來說，最終的數(shù)據(jù)產(chǎn)出都是依靠測序技術，現(xiàn)階段的三代測序成本仍然較高，如果以比較高的投入來測非常多的三代數(shù)據(jù)是不太現(xiàn)實的。也就是說，只能在成本與高期望之間，選擇一個比較適中的平衡。因此，是否選擇使用單細胞全長測序技術，有如下幾個建議：

1、傳統(tǒng)的 Bulk-seq 研究中，借助 illumina、MGISEQ、Pacbio、Nanopore 等二代、三代測序技術同樣可以測到較多的可變剪切、融合基因、新轉(zhuǎn)錄本等。唯一讓研究者困擾的是測到的新序列太多（2000+)，較難篩選過濾做后期功能驗證。單細胞全長轉(zhuǎn)錄本測序的一個優(yōu)勢，是對新測到的轉(zhuǎn)錄本加上 ? 細胞亞群 ? 的標簽，可以比較快速的篩選，如腫瘤細胞、免疫細胞亞群中的特異性新轉(zhuǎn)錄本，節(jié)省下游驗證成本。這類課題是比較適合單細胞全長測序，最終結合實際數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)特異性轉(zhuǎn)錄本。

2、如果已經(jīng)指定了某個關鍵基因，想研究該基因是否在特定亞群中存在可變剪切或新轉(zhuǎn)錄本、融合基因等，比較建議先從已發(fā)表文章，或者公開數(shù)據(jù)庫（如 htps:/singlecell.broadinstitute.ore/single_cell) 中，預先査詢該基因的單細胞表達豐度。如果該基因表達量較低，并且亞群（如 T 細胞）的表達比例低于 50%，則要慎重選擇單細胞全長測序方法。解決方法是可以把這群細胞通過流式、磁珠等技術分選出來（人為富集），單獨對這群細胞進行單細胞二代 + 三代測序。

3、從上述的 MUC1 未檢測到轉(zhuǎn)錄本，而 MUC2 檢測到多條新轉(zhuǎn)錄本的例子來看，在現(xiàn)階段較低測序投入情況下，三代全長技術更傾向于測出來高豐度的轉(zhuǎn)錄本。從另外一個角度來說，如果某條轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)在三代全長的表達矩陣中，也就意味著該轉(zhuǎn)錄本在真實細胞中的基礎表達豐度仍然較高。這種方式相當于過濾掉了低豐度的轉(zhuǎn)錄本，這個對于 siRNA 干擾、膜蛋白、lncRNA 項目來說算是增加了個較為可信的屬性。另外，如果一定要看 MUC1 基因的轉(zhuǎn)錄本，其實可以通過 IGV 導入二代測序的 BAM 文件，直接查看該基因的原始測序序列，可以在一定程度上通過已經(jīng)測到的這些 reads 來探索該 reads 分屬于哪條轉(zhuǎn)錄本（如果該基因存在多種轉(zhuǎn)錄本的話）。

4、單細胞三代全長可以直接給出來每條新轉(zhuǎn)錄本的序列，不過測序錯誤的情況也時常發(fā)生，所以后期驗證必不可少。